Jak jsme přišli k rukám a nohám

Přemýšleli jste někdy nad tím, jak se vlastně vyvinula lidská ruka a lidská noha?  Ve skutečnosti nejde o jednu otázku, ale nejméně o dvě či spíše tři klíčové otázky: Jak se z párových rybích ploutví vyvinuly přední a zadní kráčivé končetiny? Jak z jednolitého bočního ploutevního lemu vznikly přední (prsní) a zadní (břišní) párové ploutve ryb? Jak se vytvořily na víceméně válcovitém či spíše torpédovitém těle nejstaršího předka obratlovců symetrické boční vychlípeniny - ploutevní lem?

Ani na jednu z těchto otázek zatím neznáme úplnou, vyčerpávající odpověď. Přesto už toho současná věda ví o procesech, které nakonec vedly až k lidské ruce, poměrně hodně.

Představíme-li si prvotního obratlovce jako jakési torpédo, pak jeho morfologická odlišnost od mnoha bezobratlých není  příliš velká - základní plán válcovitého těla je typický i pro ně (například slimák, pakobylka,..). Rozlišení těla do jednotlivých úseků od předního konce k zadnímu (můžeme si pomoci analogií s tarifními pásmy na železnici nebo placené dálnici) řídí skupina takzvaných homeotických (Hox) genů. Ty jsou na chromozómu uspořádány pohromadě, za sebou, podobně jako ony stanice na železniční trati. A každý z nich vymezuje úsek v předozadní ose těla. V tom je právě odlišnost "torpéda-válce" obratlovce od "torpéda-válce" bezobratlého. Zatímco bezobratlí mají jen jednu sadu Hox  genů na jednom chromozómu, obratlovci mají takové sady čtyři. Obr.1

Tento "nadbytek" dává evoluci lepší  možnost vytvářet v různých vrstvách od povrchu těla do jeho nitra  kombinace z jednotlivých sad Hox genů nezávisle na základním pořadí tělních segmentů, které musí vždy zůstat zachováno. Obr.2

A odtud je už jen krůček k tomu, aby si vývoj trochu "pohrál" a nejrůznějším způsobem upravoval a modifikoval, do té doby homogenní, párovou strukturu -  ploutevní lem, aniž by bylo ohroženo ono pevné pořadí jednotlivých úseků od předního k zadnímu konci těla, neboť toto pořadí je určováno stále původním způsobem, odpovídajícím stavu, kdy ještě existovala jen jediná sada homeotických genů. Konkrétně zmíněná kreativita vývoje  znamená v případě ploutevního lemu přibrání dalšího hráče - molekul ze skupiny "T-box". Tyto molekuly reagují (zprostředkovaně, přes další regulační molekuly) na homeotické geny Hox9, které jsou ve svrchní vrstvě prostředního zárodečného listu - mezodermu exprimovány v dlouhém pásmu sahajícím až k přednímu okraji těla. Obr.3

Prvním krokem ke vzniku lidské ruky nebo nohy by tak bylo zčtveronásobení sady homeotických genů, které stálo u vzniku obratlovců.

T-box geny (zkracovány také Tbx) jsou před teprve zhruba deseti lety objevenou skupinou genů. Kódují proteiny, které se váží do regulačních oblastí jiných genů a tím vyvolávají jejich transkripci – vlastně je tak „zapínají“. Pozoruhodné je, jak se T-box geny váží na DNA v oblastech regulačních sekvencí těchto genů.  Vazbu zajišťuje zhruba 180 aminokyselin dlouhá, silně zakonzervovaná, oblast - T-doména. Ta se nachází poblíž NH₂ (N) konce proteinu. Svou sekundární strukturou se podobá některým úsekům molekul imunoglobulinů nebo také transkripčnímu faktoru různých genů imunitního systému – takzvanému NF-κB (vysl. [ en ef kapa bí ]). Podobnost T-domény  s motivy některých proteinů imunitního systému ovšem vůbec neznamená, že by T-box geny měly něco společného s imunitními funkcemi. Jenom to ukazuje na to, že je během evoluce opakovaně využíváno toho, co už se osvědčilo.

 T-doména se váže dvěma α-helixy do malého žlábku dvoušroubovice DNA a, na rozdíl od jiných transkripčních faktorů, nezpůsobuje svým navázáním ohyb vlákna DNA. Doplňkové vazby do velkého žlábku DNA zase vycházejí právě z těch oblastí T-domény, které se podobají úsekům molekul imunoglobulinů. Naproti tomu podobu vazebného místa T-domény na DNA určuje pořadí zúčastněných bazí, které je zase charakteristické pro geny, které jsou navázáním T-domény regulovány. Obr. 4

T-box geny se poprvé objevují u nejprimitivnějších mnohobuněčných živočichů. Byly například objeveny i u málo známého mořského ‛živočicha’ vločkovce (Trichoplax), který je v podstatě tvořen pouze dvěma vrstvami buněk. U organismů, kde během vývoje oplodněného vajíčka vznikají tři zárodečné listy – endoderm, mezoderm a ektoderm – jeden typ T-box genů (VegT) hraje roli při odlišení právě dvou z těchto zárodečných listů.  T-box gen Brachyury zase ovlivňuje vznik notochordu (tedy struny hřbetní) – pásu buněk mezodermálního původu, který pomocí kontaktu se sousedním ektodermem indukuje vytváření nervové trubice.

Pro vznik končetin hrají zásadní roli dva, velice podobné T-box geny ze skupiny – jakési „rodinky“ - T-box 2. Jedná se o geny T-box 4 a T-box 5. T-box 5 jednoznačně určuje identitu přední končetiny  - ať už je to prsní ploutev, přední noha žáby, křídlo nebo lidská ruka; T-box 4 určuje, že se bude jednat o břišní ploutev nebo zadní nohu, v případě člověka o nohu. U kopinatce (ten ještě žádné přední ani zadní končetiny nemá) ještě existuje jeden T-box 4/5 gen.  Zřejmě duplikací genomu došlo k rozrůznění tohoto kopinatčího genu na T-box 4 a T-box 5. Obr.5

Někdy po této duplikaci muselo dojít k zafixování funkce definování přední a zadní končetiny u takto rozrůzněnýchT-box genů-potomků.

Iniciace vzniku končetinového pupenu během vývoje embrya vychází z vnější - povrchové vrstvy prostředního zárodečného listu – mezodermu ještě před tím, než se objeví sebemenší náznaky vzniku tohoto končetinového pupenu. V té době skupina buněk u povrchu mezodermu začne produkovat fibroblastový růstový faktor 10 (FGF 10) a také proteinový produkt T-box 5 nebo T-box 4. Je tedy jasné, že už v této „molekulární“ fázi dochází ke specifikaci přední versus zadní identity končetiny. Dokládá to nakonec i třetí molekulární faktor – signální molekuly z rodiny Wnt, působící v souhře s T-box geny, kdy u budoucí přední končetiny je exprimován (spolu s T-box 5) Wnt2b, zatímco u zadní končetiny je to Wnt8c (spolu s T-box 4). U ryb celý proces ještě začíná tak, že nejprve z širší oblasti mezodermu začnou migrovat právě buňky exprimující gen T-box 5 (4), do již ostřeji vymezené zóny nazývané končetinové políčko (Limb Field) a teprve po jeho ustavení dochází k produkci FGF 10 a dalších faktorů.

První rolí T-box genů zřejmě bylo ovlivňovat procesy formování zárodečných listů a jejich interakcí, mimo jiné prostřednictvím řízení adhezivity a migrace buněk a tak není divu, že i právě migraci buněk do končetinového políčka řídí právě T-box geny. A je celkem jedno, že u pokročilejších obratlovců, než jakými jsou ryby, už k žádné migraci buněk v rámci mezodermu na začátku molekulární fáze vývoje končetinových pupenů nedochází. T-box geny už si podržely svou funkci dohledu nad přední/zadní identitou končetiny.

Molekulární fáze přejde do další, když FGF 10,  produkovaný buňkami končetinového políčka, ovlivní přilehlý ektoderm, kde tím dá vzniknout dalšímu organizačnímu centru, takzvanému AER (Apical Ectodermal Ridge). AER zase produkuje FGF 8, který difunduje zpět do nitra, směrem k mezodermu. Tam iniciuje vznik třetího organizačního centra. Tím je zóna polarizační aktivity (ZPA), která je opět mezodermální. ZPA se nachází  vždy v proximální (= blíže tělu) posteriorní  (= směrem k zadnímu konci těla) části končetinového pupenu a vytváří produkt Hox genu Sonic hedgehog.

 Sonic hedgehog difunduje šikmo dopředu (anteriorně) a distálně (= směrem ke špičce rostoucího končetinového pupenu) a jednotlivé zóny jeho stejné koncentrace spouštějí ve třech časových fázích (I., II. a III.) expresi genů Hox A a především Hox D, které mají vliv na formování základů a postupný vývoj jednotlivých kostí vznikající končetiny. První fáze je ještě na proteinu Sonic hedgehog nezávislá, takže přechod z ní do fáze II. indukuje právě tento protein. Obr. 6

Tyto tři fáze jsou obvykle dávány do souvislosti se třemi zónami vznikající končetiny: stylopodem (nejvíce proximální část budoucí končetiny, reprezentovaná humerem nebo femurem – fáze I.),  zeugopodem (reprezentovaná např. radiem a ulnou – fáze II.) a autopodem (články prstů u čtvernožců – fáze III.). Obr.7, Obr.6

Role T-box 4 a T-box 5 genů během „molekulární“ fáze iniciace vzniku končetinového pupenu v povrchové vrstvě mezodermu ukazuje na to, že prvotní a jedinou rolí této dvojice genů nebylo specifikovat přední nebo zadní končetinu, ale zahajovat proces formování nějaké struktury vystupující bočně z povrchu torpédovitého těla. To byla asi původní úloha ještě nerozlišeného kopinatčího T-box 4/5 genu. Indukce vzniku ploutevního lemu dobře odpovídá takové představě. Docházelo k ní zřejmě v celém pásu podél obou boků, což je v hrubých obrysech podobné indukci vzniku nervové trubice pomocí pruhu mezodermálních buněk – notochordu. Tento proces je také v režii T-box genů, tentokrát ze skupiny - rodiny  Brachyury a VegT. Také ovšem jeden detail ukazuje na podobnost obou procesů - promotorové a enhancerové oblasti genů spouštěných proteinem Brachyury reagují i na protein T-box 5.

Donedávna však předpokládanou roli genu T-box 4/5 při formování ploutevního lemu nepřímo dokládal právě jen strunatec (ne však obratlovec) kopinatec. A tak výzkumníky z takzvané disciplíny „Evo-Devo“, která se snaží právě přes porozumění detailům procesů vývoje zárodku vysvětlit průběh evoluce živých organismů, rozdělovala otázka,  nebo spíše pochybnost, jestli  ploutevní lem byl skutečně mezistupněm vzniku párových končetin. Paleontologické nálezy fosilií prvních obratlovců totiž poskytovaly trošku odlišný obraz: zástupci vyhynulého kmene obratlovců - pancířnatých (Placodermi) mají totiž vyvinutý jen přední pár ploutví, který nasedá na lebku. To by tedy mohlo ukazovat na jiný průběh událostí, v rámci kterého nejprve vznikl v hlavové části jeden pár ploutví, který byl během  dalšího vývoje jako již hotová struktura duplikován do zadní části těla, kde se objevil jakožto břišní ploutve.

Na druhou stranu jiný vyhynulý  kmen obratlovců -  trnoploutví (Acanthodii) Obr. 8 z období siluru až permu, s řadou párových ploutví (ovšem poněkud menších) mezi párem prsních a párem břišních ploutví,  by mohl být jakousi přechodnou formou mezi ploutevním lemem a dvěma páry ploutví. To by zapadalo do scénáře, podle kterého nediferencovaný gen T-box 4/5 kódoval vznik ploutevního lemu a po rozdělení na T-box 4 a T-box 5 mohl začít proces postupného rozrůzňování jejich senzitivity vůči předo-zadní poziční informaci, vytvářené homeotickými geny ve svrchní vrstvě mezodermu.

Nesoulad mezi „Evo-Devo“ a paleontologií nakonec smazala sama paleontologie. Tím novým podnětem je objev dvou fosilií z takzvané Cheng-jiangské fauny, pojmenované podle naleziště v jihočínské provincii Ju-nan. Myllokunmingia fengjiaoa a Haikouichthys ercaicunensis jsou obratlovci rybovitého (torpédovitého) tvaru těla, zařazovaní mezi bezčelistnaté obratlovce (Agnatha) (skupina, kam patří mihule a mořské sliznatky) nebo alternativně, ale s určitými pochybnostmi, k chimérám – což je skupina druhů velice bizarních rybovitých obratlovců ze třídy paryby. Cheng-jiangská fauna je datována do období kambria, je tedy daleko starší, než byly nálezy prvních doposud popsaných obratlovců. Podstatné je, že obě fosílie mají ploutevní lem. Obr.9

A tím – alespoň na nějakou dobu – nastává soulad mezi oběma disciplínami. Právě nejnovější poznatky o postupném rozrůznění  T-box genů z rodiny T-box 2, do které patří i T-box 4 a 5, stejně jako vynořující se obrázek celé velké skupiny T-box genů coby prvotně regulujících procesy indukce mezi jednotlivými zárodečnými listy, probíhající většinou v prostorovém uspořádání pásů, podporují předpokládaný význam ploutevního lemu jakožto mezistupně vývoje párových končetin. Pásový charakter specifikace polohy budoucí končetiny pomocí exprese Hox9 genů v povrchové vrstvě mezodermu (Obr 3.), kdy umístění končetinového políčka přední a zadní končetiny předurčují spíše přední a zadní okraje delších pruhů jednotlivých kombinací Hox9, než striktně vymezené úseky, je dalším argumentem.

Jako hypotéza by se mohlo uplatnit vysvětlení, že rozrůznění T-box 4/5 na dva separátní geny sehrálo zásadní roli při vzniku ploutve. Bezprostředně po zdvojení musely oba geny (T-box 4 a T-box 5) kódovat ještě stejnou funkci při formování ploutevního lemu. Tím že byly najednou dva, ocitl se každý z nich pod pouze polovičním selekčním tlakem. Tím se mohl otevřít prostor pro vývoj nové, složitější struktury – ploutve. Vznik párových ploutví by potom mohl být nahlížen spíše než jako rozpad ploutevního lemu jako expanze jeho strukturní modifikace.

Vývoj končetiny, od nejjednodušší ploutve po vysoce specializované ruce a nohy u primátů, můžeme sledovat také na úrovni základních elementů kostry končetiny. Zásadní roli pro  sestavování takto konstruovaných stromů vývoje hrají tři bazální elementy, takzvaná bazalia, ze kterých u ryb vybíhají jednotlivé paprsky ploutví (radialia). U nejpůvodnějších do dnešní doby přeživších čelistnatých obratlovců (Gnathostomata) – paryb, jsou v ploutvi přítomna tři bazalia: propterygium, mesopterygium a metapterygium.  V dalším vývoji dochází k větvení mezi skupinu ryb Actinopterygii, která zahrnuje také většinu běžně známých ryb (takzvané ryby kostnaté – Teleostei) a v základu jejich ploutve dochází ke ztrátě metapterygia – nejvíce posteriorního bazálního elementu. Kostěné paprsky ploutví tak vycházejí z propterygia a dvou kostí vzniklých z mesopterygia.  Druhou vývojovou větev tvoří skupina označovaná jako Sarcopterygii. Tu zastupují lalokoploutvé ryby (Crossopterygii)  – známá latimerie a dvojdyšní (Dipnoi) – jen o málo méně populární ryby bahníci. Jako její pokračování se ovšem do této skupiny zahrnují také všechny třídy obratlovců navazující na lalokoploutvé, tedy obojživelníci, plazi, ptáci a savci. U skupiny Sarcopterygii proběhl opačný proces – došlo ke ztrátě propterygia a mesopterygia, takže ze tří původních bazalií zbylo jediné, metapterygium. A právě na metapterygium pak u pokročilejších druhů navazují prsty. Obr.10

Metapterygium ovšem mohlo hrát významnou roli ve vývoji končetin i z jiného důvodu. Někde na přechodu mezi parybami a rybami dochází k pootočení metapterygia o 90°. Ve skutečnosti se pochopitelně tato kost nepootočí, ale v průběhu embryogeneze, právě když vzniká a roste končetinový pupen, dělí se buňky v zadní (posteriorní) části budoucího metapterygia více, než v přední (anteriorní), takže zadní část se jakoby vytočí ven, v distálním směru vznikající končetiny. Dokonce se mluví o „vysvobození“ osy končetiny od předozadní osy těla. Zajímavé je, že u těch druhů, kde je hlavní osa metapterygia ještě shodná s osou těla, nebyla detegována v končetinovém pupenu exprese genu Sonic hedgehog, která se vždy objevuje tam, kde je již metapterygium natočené směrem ven z těla. To by mohlo znamenat, že Sonic hedgehog je tím genem, který odstartoval vývoj, vedoucí přes větší autonomii celé končetiny k takovému jejímu typu, ve kterém hraje zásadní roli právě metapterygium, tedy ke kráčivé končetině suchozemských obratlovců.

Protažené metapterygium se tak vlastně stává hlavní osou končetiny. Všechny kostěné elementy, které z něj vybíhají směrem k přednímu konci těla (anteriorně) jsou pak označovány jako preaxiální, ty které jdou směrem dozadu (posteriorně) jako postaxiální.  Obr.10

Na základě paleontologických dat byly dlouhou dobu prsty na kráčivé končetině vysvětlovány jako deriváty radialií rybí ploutve. Mělo dojít k přeskupení těchto radialií tak, že vznikl prototyp pětiprsté kráčivé končetiny. V této teorii vznikly první trhliny s nálezy fosilií prvních čtyřnohých obratlovců  se šesti (Tulerpeton), sedmi (Ichthyostega) a dokonce osmi (Acanthostega) prsty. Nakonec vlastně z původní představy nezůstal kámen na kameni: Je dost dobře možné, že nejprve došlo u předků čtyřnohých obratlovců ze skupiny Sarcopterygii – tzv. Panderichthyid k přestavbě celkového tělního plánu na „suchozemský“ (oči přesunuté nahoru, takže umožňující sledování světa nad hladinou, vymizení hřbetní a řitní ploutve, ..) za stálého přetrvání obou párů lalokovitých ploutví (Panderichthys). V další fázi pak došlo k přeměně těchto ploutví na „kráčivé“ končetiny s prsty. Jenže pozor – stále u (dost možná) plně vodních živočichů (Crassigyrinus)! Pak už tedy pochopitelně zbývalo jediné – byl zavržen i výklad, podle kterého jsou prsty homologní struktury k radialiím rybí ploutve a jakožto postaxiální elementy byly vysvětleny jako nová struktura, typická pro kráčivou končetinu. A jsme zpátky u fáze formování autopodu v embryogenezi a tím pádem u fáze III. exprese Hox genů v končetinovém pupenu. Skutečnost, že pro každou fázi mají zúčastněné Hox geny zvláštní promotory, již byla zmíněna.

Nabízí se tak vysvětlení, které je vlastně na samém protipólu k oné „zbourané“ teorii. Podle něj by celou přeměnu ploutve Sarcopterygií v končetinu s prsty mohla mít na svědomí nějaká přestavba na úrovni regulačních elementů zmíněných Hox genů (též obr. 7).

V počátku neustálený počet prstů, který je vyšší než pozdějších pět, by zase mohl být zapřičiněn ustavováním vztahů v  nitrobuněčné dráze přenosu signálu proteinu Sonic hedgehog. Tuto dráhu tvoří transmembránový receptor, na který se Sonic hedgehog navazuje – protein Patched, s ním sousedící protein Smoothened a také nitrobuněčný transkripční faktor Gli. Právě asi variabilita Gli je nejpravděpodobnějším vysvětlením  šesti, sedmi a osmi prstů u Tulerpetona, Ichthyostegy a Acanthostegy. Obr.10

Text: Petr Hanák

Grafika: Martina Hanáková, Petr Hanák

• Akademon: Jak vzniklo oko?

• Homeoboxové geny a jejich role v ontogenezi a fylogenezi

• OSEL: Vršenka - budoucí supernova mezi laboratorními organismy?

• OSEL: Osekvenován genom čtverzubce Tetraodon nigroviridis

• OSEL: Chemické "otisky prstů" pakobylky

• OSEL: Nové protinádorové léky – cílené vypínání konkrétních genů

• Vesmír: Světluška lovící světlušky aneb Boj o lucibufagin

• OSEL: Jeskynní pijavice Croatobranchus – nový druh hned za našimi humny

• Toxicology: Léky proti rakovně na bázi inhibitorů Met receptoru

evo-devo - osobní WeBlog Petra Hanáka

Odkazy na stránky s biologickou tematikou:

• OSEL

• Toxicology

• Vědecký výbor pro geneticky modifikované potraviny a krmiva