DOKUMENTY
ALTERNATIVY
MÍSTO POKUSŮ SE ZVÍŘATY
MÍSTO POKUSŮ SE ZVÍŘATY
Ohleduplnost - zlepšení v oblasti péče a zacházení s laboratorními zvířaty za účelem snížení možné bolesti, utrpení a stresu bez vlivů na výsledky experimentů. Ohleduplnost může vést k přesnějším experimentům, protože bolest a stres způsobují biologické změny, jež mohou zkreslit výsledky testu či experimentu. Ohleduplnost zahrnuje obohacení prostředí, ve kterém jsou zvířata držena, poskytující příjemnější místa k životu, umístění zvířat do skupin namísto držení o samotě, poskytující lepší potravu a zlepšení použití anestetik a analgetik tam, kde je to vhodné.
Redukce znamená použití méně zvířat než dříve. V procedurách by měl být použit pouze minimální počet zvířat nezbytných pro dosažení požadovaných výsledků. Pečlivé navržení experimentů umožňuje vědcům vypočítat minimální počet zvířat potřebných do experimentálních a kontrolních skupin za účelem poskytnutí statisticky průkazných výsledků. Např. test LD50 akutní toxicity je používán pro určení dávky chemikálie nutné k usmrcení 50% použitých zvířat. Je hlavně prováděn s průmyslovými chemikáliemi a agrochemikáliemi pro ověření, zda vyhovují požadavkům klasifikace, označování a transportu. Test je zřídkakdy použit při testování léků a kosmetiky. Klasický test LD50 vyžaduje 60 až 80 zvířat. Schválená alternativa, "Fixed-Dose Procedure", vyžaduje pouze 20 zvířat na test a nedávno se jí dostalo mezinárodního přijetí. To zahrnuje tzv. "step-wise" a "up-and-down" metody, jež limitují maximální dávku chemikálie podané zvířatům a také vyžadují užití menšího počtu zvířat. Potřeba opakování výzkumů může být snížena v případě, že jsou dostupné informace o biologických vlivech chemikálií. počítačové databáze jsou nyní používány k snadnějšímu dosažení informací.
Náhrada potřeby použití živých zvířat v jakýchkoliv laboratorních postupech je konečným cílem mnoha vědců a některých ochranářských organizací. Možná náhrada pokusů alternativami existuje:
TYPY NÁHRADNÍCH ALTERNATIV
Různorodé metody bez použití zvířat jsou již široce používány v základním a aplikovaném výzkumu i jako předběžných kontrolních testů. Jsou také někdy využívány jako doplňkové metody vedle pokusů na zvířatech. Využití následujících typů metod bez použití zvířat přispívá ke snížení počtu pokusů na zvířatech prováděných v minulých letech. Snižují také stupeň nebo pravděpodobnost nepříznivých efektů objevujících se u následných studií zvířat.Fyzikálně - chemické metody
Stanovení chemických vlastností látky poskytne některé informace o možných toxických efektech. Např. sloučeniny s pH vyšším jak 10 nebo nižším než 3 budou pravděpodobně dráždit pokožku a oči, a proto testování dráždivosti na zvířatech není u těchto sloučenin nutné. Důležitý pokrok byl také učiněn ve vývoji alternativ k Draize očnímu testu. Jedním z nich je EY-TEX, ve kterém je proteinová matrice vystavena účinkům chování oční rohovky. Matrice se stále více a více zakaluje při styku s určitými chemikáliemi. Ačkoliv je nepravděpodobné, že jakýkoli jednotlivý in vitro test by mohl nahradit použití Draize očního testu pro všechny účely, je už běžné použití několika kombinovaných doplňkových metod nepoužívajících zvířata. Další typ fyzikálně-chemického testu úspěšně nahradil zavedený test na zvířatech: vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC) je nyní používána pro analýzu nečistot inzulinu. Dříve byl test prováděn na myších pro prověření čistoty každé nové šarže inzulinu.Matematické a počítačové modely
Vědci mají nyní k dispozici značnou moc počítačů, jež stimulují vývoj různých rafinovaných matematických a počítačových modelů.Kvantitativní strukturálně - aktivní vztahy (QSAR) mohou být v některých případech použity pro předpověď možných biologických efektů nových složek. Rovnice QSAR se pokoušejí definovat vztahy mezi strukturami chemických sloučenin (např. tvar, velikost a reaktivnost jednotlivých skupin přítomných atomů) a jejich biologickou aktivitu. Tato informace může poté určit způsoby změn struktury molekul za účelem pozměnění jejich terapeutických toxických vlastností. Počítačové modely, jako je tento, mají možnost zredukovat použití zvířat využitím existujících informací z výzkumu zvířat podniknutých v minulosti, pro předpověď možné toxicity úzce příbuzných sloučenin, jež doposud nebyly testovány na zvířatech.
Navrhování léků pomocí počítače (CADD) používá interaktivní grafiku v raných stadiích vývoje nových sloučenin. Hormony, léky a jiné chemikálie často projevují své vlastnosti interakcemi se speciálními strukturami (receptory) na povrchu buňky nebo v buňce. Jestliže jsou známy tvary receptovaných míst, je možno navrhovat molekuly, jež se k nim budou hodit. Molekuly mohou být zobrazeny na obrazovce počítače a umístění potencionálně vhodné molekuly na určitému receptoru tak může být pozorováno.
Matematické modelování biochemických a fyziologických procesů je také možné. Např. herbicid Paraquat způsobil stovky případů otravy lidí, protože byl selektivně toxický pro plíce. Počítačová prověrka chemikálie vede k bezpečnějším, ale ne méně účinným herbicidům. Techniky matematického a počítačového modelování jsou stále ještě v relativně raných stádiích vývoje. Jejich schopnost předpovídat užitečné nebo toxické vlivy chemikálií závisí na množství a kvalitě informací dostupných pro využití jejich prospěšnosti a toxických efektům netestovaných sloučenin jednoduše ze znalostí jejich trojrozměrné struktury.
Nižší organismy
Obratlovci mají vyvinutější nervovou soustavu a tím spíše zažívají bolest a utrpení než bezobratlí živočichové. Mnoho nižších organismů, včetně bakterií, řas, hub a rostlin, tak jako protozoa, hmyz, měkkýši a další bezobratlý je běžně používáno ve vývoji alternativních metod.Ačkoliv se to může zdát nepravděpodobné, člověk sdílí některé důležité vlastnosti s mikroorganismy jako jsou bakterie. Jeden z nejlépe zavedených testů, pro prověřování velkého množství chemikálií na potencionální toxické efekty, zahrnuje zjišťování, zda chemikálie je schopná způsobit poškození genetického materiálu v bakteriálních buňkách. Tento test vyvinul v polovině sedmdesátých let Bruce Ames se svými kolegy. Používá klony bakterie Salmonela typhimurium pro detekci mutagenních složek, z nichž jsou mnohé též karcinogenní. Nicméně Amesův test může poskytovat chybné výsledky, a proto musí být použit v kombinaci s jinými typy testů.
Určité druhy světélkujících bakterií jsou používány v jiném testu toxicity. Energie pro jejich produkci světla pochází z respirace. Jelikož biochemické procesy respirace jsou velmi podobné u všech organismů, pak jakákoliv chemikálie, jež narušuje respiraci u bakterie, může to samé způsobovat u člověka a mohla by proto být pro člověka toxická.
I jiné organismy jsou v testech používány. Např. kvasinky patří k eukaryotům, a proto jejich buňky se více než buňky bakteriální podobají savčím (bakterie jsou prokaryontní). Protože jejich chromozomová struktura se podobá savčí, by mohly kvasinky být vhodnější pro odhalení určitých typů genetického poškození. Kvasinky jsou také používány v testech pro detekci sloučenin, jež mohly způsobit porušení kůže za přítomnosti světla (fototoxiny).
Laboratorní zvířata, zejména krysy a králíci, jsou široce používány pro určení, zda nové chemické sloučeniny způsobují abnormality ve vývoji plodu, tzv. zda jsou teratogenní. Používá se množství předběžných kontrolních technik na teratogenitu, jeden z nich používá nezmara, jež patří k bezobratlým živočichům. I když tyto testy mohou znamenat možnost redukce použitých živých obratlovců, nemohou být považovány za plnohodnotnou náhradu, protože rozmnožování a vývoj savců jsou složitější.
|
LAL TEST
Některé léky a jiné terapeutické sloučeniny, jako jsou solný a glukózový roztok, jsou podávány nitrožilně. Jestliže je některý roztok kontaminován určitými bakteriemi (třeba mrtvými), mohou způsobit pacientům horečky. Horečku způsobující sloučenina - pyrogen je složkou bakteriální buněčné stěny. Je také známa jako endotoxin. Králící bývali tradičně používáni v testech na přítomnost těchto pyrogenických endotoxinů. Králíkům (3 na 1 test) je vpichována testovaná látka, poté jsou u nich pozorovány příznaky horečky. Nyní existuje platná náhrada, která používá krev kraba Limulus. Vzorky krve jsou získávány z krabů chycených v přírodě, jež jsou poté vypuštěni nepoškození zpět. LAL je extraktem krevních buněk (bílých krvinek) kraba. Při testu je malé množství testované látky inkubováno ve zkumavce se stejným množstvím krevního extraktu. Za přítomnosti bakteriálního endotoxinu, vzniknou ve zkumavce pevné chuchvalce, ale v případě nepřítomnosti toxinu žádné chuchvalce nevzniknou. LAL test je citlivější než test s králíky a je též ekonomičtější, vhodnější a spolehlivější. LAL je náhradou pyrogenního testu na králících, protože nevyžaduje laboratorní zvířata. Zahrnuje v sobě redukci, protože 1 krab nahradí několik králíků. A je také ohleduplný, protože krabi jsou pouze krátkodobě vyrušeni z jejich života v přírodě a poté je jim dána svoboda, zatímco králíci jsou uvězněni v laboratorních klecích. |
Raná vývojová stadia obratlovců
Jelikož běžné zákony chrání pouze zvířata, jež dosáhla určitého vývojového stupně, bylo navrženo několik alternativních testů s použitím raných vývojových stadií obratlovců. Je nepravděpodobné, že by trpěli bolestí v tak raném stadiu, protože jejich nervová soustava není dostatečně vyvinuta. Např. kuřecí embrya, žabí pulci a krysí emrya jsou používána v testech, jež byly vyvinuty pro identifikaci teratogenů. Test využívající slepičích vajec je také používán pro určení možné dráždivosti.Test chorion-allantoické membrány (CAM) na možnou dráždivost. Byl navržen jako náhrada Draize očního testu. Jedna z membrán kolem kuřecího embrya je používána pro napodobení situace, kdy látka přijde do kontaktu s okem.
Tkáňové kultury a jiné in vitro testovací systémy
Historie tkáňových kultur se datuje od roku 1907, kdy nervová tkáň žab byla úspěšně udržována naživu mimo tělo po několik týdnů. Buňky, tkáně a dokonce i celé orgány (nebo části orgánů) mohou nyní být udržovány naživu mimo tělo po dobu přesahující 24 hodin. Buňky jsou uschovány v pufrovaném roztoku s živinami, tzn. za podmínek, jež věrně napodobují jejich fyziologickou situaci.V orgánových kulturách nejsou buňky odděleny, a proto mohou stále navzájem na sebe působit, tak jak to dělají v neporušeném organismu. Ačkoliv kompaktní struktura orgánových kultur zabraňuje přístupu živin a kyslíku ke všem buňkám, právě proto mají kultury pouze omezenou dobu života. Potřeba nepřetržitého opětovného zakládání takovýchto kultur předpokládá neustálé dodávání nových tkání, odvozených buď ze zvířat nebo z člověka. Orgánové kultury jsou používány např. v kontrole teratogenů a v testování kožní dráždivosti.
V buněčných kulturách je propojení mezi individuálními buňkami porušeno. Izolované buňky jsou obvykle pěstovány jako monovrstva (tzn. jako "koberec" o tloušťce jedné buňky), jež je rozprostřena po dně kultivační nádoby. Buňky získané přímo z organismu, jež jsou pěstovány v kultuře, jsou známy pod názvem primární buněčné kultury. Příležitostně se mohou tyto buňky spontánně přetrnsformovat do souvislých buněčných linií, jež jsou schopny přežít v podmínkách in vitro po mnoho let. Mnoho souvislých buněčných kultur je komerčně dostupných, např. HeLa buňky, jež byly původně odebrány z krčního nádoru jedné Američanky před 30-ti lety.
Jen v předešlých dvaceti letech byli vědci schopni úspěšně kultivovat široké spektrum typů buněk. Využití sterilních technik a zahrnutí antibiotik do médií předchází přerůstání kultur bakteriemi a houbami. Detailní porozumění požadavkům izolovaných buněk na kyslík, teplotu a vlhkost je hlavním bodem. Každý typ buněk, ať už jaterních, ledvinových, srdečních, mozkových či kožních, má své vlastní požadavky, jež musely být usilovně objednány.
Byl také vyvinut komplex metod buněčných kultur, zahrnující společné kultury dvou nebo více typů buněk, např. konstrukce ekvivalentů živé lidské pokožky. Různé metody buněčných a tkáňových kultur našly široké použití při stanovování potencionálních toxických vlivů chemikálií.
Jiné in vitro metody zahrnující použití subcelulárních frakcí (např. izolované a čištěné organely a enzymy), suspenze čerstvě izolovaných buněk a krátkodobě udržované tkáně.
Prvotní tkáňové vzorky používané pro založení kultur v laboratořích jsou často získávány ze zvířat. Nicméně jediná krysa poskytne dostatek buněk pro mnoho rozdílných kultur. Někdy také mohou být použity lidské tkáně. Určité lidské buňky a kultury jsou snadno dostupné, např. krevní, z pupeční šňůry, placenty a chrupavek. Vzorky lidské pokožky mohou být často získávány z odpadových tkání při operacích. I když může být obtížnější získat materiál z určitých lidských orgánů, jako jsou játra, ledviny a plíce, někdy jsou odstraňovány malé vzorky tkání za účelem diagnózy (biopsie) a ty mohou poskytnout potřebný materiál pro kultury. Postmortální lidské kultury mohou být také využity, za tímto účelem se odebírají velmi krátce po smrti. Použití lidských tkání v sobě zahrnuje mnoho složitých etických a bezpečnostních otázek.
Tkáňové kultury a další in vitro systémy již mají velký význam v mnoha oblastech biomedicíny. Buněčné kultury jsou značně používány ve vývoji a ověřování nových léků, při výrobě vakcín a testech toxicity. Použití těchto metod po více než 12 let v jedné farmaceutické firmě značně snížilo jejich roční použití myší pro ověřování antivirových chemikálií z 16.000 na 1600. Ve stejnou dobu se počet sloučenin, jež skutečně testovali, zvýšil z 1000 na 22.000 za rok.
Metody buněčných kultur mají také pozoruhodný vliv na počet opic použitých při výrobě vakcíny proti obrně. Počátkem 70-tých let bylo v USA každoročně za tímto účelem použito 50 000 opic a kolem 5000 v Británii. Vakcina proti obrně je nyní vyráběna pomocí lidských buněčných kultur.
Studium člověka
Tam, kde jsou proveditelné a eticky přijatelné, mohou někdy studie člověka být použity pro předcházení komplikacím způsobeným mezidruhovými rozdíly a jiných problémů spojených s chráněnými druhy zvířat.Lidští dobrovolníci jsou využíváni při testování léků a některých kosmetických a toaletních výrobků. Např., když už jsou k dispozici dostatečné důkazy o minimální toxicitě, využívají se dobrovolníci pro kožní testy dráždivosti kosmetických výrobků a tyto testy jsou preferovány před testováním na zvířatech. Testovaná látka je nanesena na velké samolepky, jež jsou přiloženy na kůži.
Většina nových léčiv je testována na zdravých dobrovolnících v počátečních fázích jejich vývoje, poté, co byl úspěšně proveden základní soubor studií na zvířatech. Náležitá etická kontrola (dobrovolníci musí být úplně informováni a dát dobrovolné svolení) a dostatečné záruky (žádné vážné poškození zdraví nemůže být akceptováno a všechny experimenty musí být prováděny pod lékařským dohledem) jsou nezbytné při studiích na lidských dobrovolnících. Ale někdy však mohou dobrovolníci pociťovat mírně nepříznivé vlivy testů, jako jsou průjmy a bolesti hlavy.
Využití dobrovolníků je zajisté nemožné u sloučenin jako jsou pesticidy, jež jsou navrhovány tak, aby byly vysoce toxické pro určité organismy, avšak selektivně. Klinické výzkumy, zahrnující přímé studie lidských pacientů, jsou součástí vývoje všech nových léků, a tak poskytují životné důležité informace o chorobách a jejich možném léčení. Metody pro léčbu předávkování léky jsou vylepšovány prostřednictvím klinických výzkumů prováděných na odděleních pro léčbu otrav v nemocnicích, kde jsou pacienti sledováni během doby, kdy je jim poskytována záchranná léčba. Informace o možném léčení těží z pozorování těchto pacientů při doplnění o data získaná v pokusech na zvířatech.
Konvenční klinické výzkumy nyní mohou být nahrazeny novými technikami, jako je nukleární magnetická rezononce (NMR), počítačová axiální tomografie (CAT) a pozitronová emisní tomografie (PET). Tyto techniky jsou neinvazní, přístroj, jež je vně těla, zobrazuje vnitřek bez porušení pacientova těla, ačkoliv někdy je nezbytná injekce barviva či jiného markeru a ta může trochu bolet. Při NMR studiích magnetické pole vytváří jasný obraz částí těla. Mimoto mohou vědci využít tohoto postupu pro měření hladin chemické aktivity ve zdravých a nemocných tkáních. PET využívá malinké množství radioaktivních chemikálií pro označení, např. oblastí mozku. Scaner detekuje tyto chemikálie a vytváří obraz pracujícího mozku. PET scanování bylo použito pro výzkum poškození specifických mozkových buněk, jež se vyskytuje u Parkinsonovy nemoci (běžná nemoc hlavně po šedesátce, jež je charakteristická progresivní ztrátou motorické kontroly, popřípadě způsobuje ochrnutí). U těchto a dalších nových neinvazních technik, je pravděpodobný nárust diagnostické a léčebné hodnoty v budoucnosti.
Postmortální studie vždy poskytovala důležité informace o nemocech člověka. Jeden z dřívějších pokroků v poznání Alzheimerovy nemoci (forma senilní demence, charakterizovaná zrychleným ubýváním nervových buněk v určitých částech mozku), pocházel z anatomických a biochemických studií prováděných na mozcích nemocných zesnulých pacientů.
Postmarketingový dohled je používán pro monitorování vlivů farmaceutických a jiných výrobků na lidskou populaci po jejich uvedení na trh. Vážné nepříznivé reakce na léčiva jsou velmi vzácné. Kvůli tomuto mohou být vyloučeny z klinických zkoušek, jež pro statistické podmínky používají relativně malé počty zdravých dobrovolníků či pacientů. Proto současný marketing léčiv může být považován za první, nepředpojatý stupeň bezpečnostních zkoušek. Zprávy o toxických reakcích medikamentů či jiných chemikálií jsou monitorovány a vyhodnocovány, např. Komisí pro bezpečnopu medicínu. Jestliže dojde k nějakému případu, mohou doporučit Licenčnímu úřadu stáhnout z oběhu výrobek, jehož se to týká.
Zdroj: Developing Alternatives to Animal Experimentation, Glaxo Group Research