TERATOGENITA
(teratogenicity)

1. Metoda

1.1. Úvod
Při odhadu a vyhodnocení toxických charakteristik chemikálie, je důležité stanovení teratogenního potenciálu. Poskytuje informace o potenciálním ohrožení nenarozených, které může vzniknout expozicí matky v průběhu těhotenství.

1.2. Definice
Teratogenita je vlastnost chemikálie, která způsobuje trvalé strukturní nebo funkční abnormality během období embryonálního vývoje.

1.3. Referenční látky
Nelze aplikovat

1.4. Princip zkušební metody
Zkoušená látka se aplikuje v odstupňovaných dávkách alespoň po část gravidity pokrývající periodu organogenese, několika skupinám gravidních zkušebních zvířat, vždy jedna dávka pro skupinu. Krátce před očekávaným datem porodu se matka utratí, odstraní se děloha a obsah se zkoumá na úhyny embrya nebo foetu a živý foetus.

1.5. Kritéria kvality
Srovnání lze provést s OECD dokumentem "Principy dobré laboratorní praxe" (ten se teprve připravuje).

1.6. Popis zkušební metody
Zdravé mladé panenské samičky srovnatelného věku a velikosti se roztřídí a určí do zkušebních skupin, a pak se pokryjí samcem se zjištěnou plodností. Oplodnění lze provést přirozeně, nebo umělou inseminací. Zkoušená látka se aplikuje denně samičkám, počínaje krátce po oplodnění a pokračuje se po celou periodu organogenese. Jeden den před termínem se foety uvolní hysterektomií (odstraněním dělohy) a zkoumají na vnitřní a skeletální abnormality.

1.6.2. Zkušební podmínky

1.6.2.1. Pokusná zvířata
Obvykle používaným druhem je krysa, myš a králík. Přednost se dává kryse a králíkovi. Je možno použít obvyklých laboratorních kmenů.

1.6.2.2. Počet a pohlaví
Pro každou úroveň dávky se používá nejméně 20 gravidních krys nebo myší, nebo 12 králiků. Je třeba zajistit, aby se vytvořilo dostatečné množství mláďat, umožňující vyhodnocení teratogenního potenciálu zkoušené látky.

1.6.2.3. Hladiny dávek
Je třeba použít nejméně 3 aplikační skupiny a jednu skupinu kontrolní. Pokud je zkoušená látka aplikována pomocí nosiče, je třeba použít i kontrolní skupiny pro nosič. Pokud je nosiče používáno, je třeba, aby byly známy jeho toxikologické vlastnosti, nesmí být teratogenní, nebo mít vliv na reprodukci. S vyjímkou aplikace je třeba se zvířaty v kontrolních skupinách zacházet stejně jako se zvířaty pokusných skupin. Aby bylo možno zvolit odpovídající hladiny dávek je doporučeno provést orientační pokusy. Není vždy nutné provádět orientační pokusy s gravidními zvířaty: porovnání výsledků orientačního pokusu na negravidních a hlavního pokusu na gravidních zvířatech může určit, zda je substance toxičtější vůči gravidním zvířatům. Pokud se provádí orientační pokus na gravidních zvířatech, je třeba zjistit dávku způsobující úhyn embrya nebo foetu. Kromě omezení fyzikálněchemickou povahou, nebo biologickými vlastnostmi látky by měla nejvyšší hladina dávky vyvolávat některé zjevné projevy toxicity u matky, jako je slabý úbytek hmotnosti, ale ne více jako 40% úhynu matek. Nejnižší hladina dávky by neměla vyvolávat pozorovatelné účinky přičítané zkoušené látce. Střední dávka (nebo dávky) by měly být umístěny geometricky mezi nejvyšší a nejnižší dávkou.

Limitní test

V případě látek s nízkou toxicitou, pokud hladina dávky 1000 mg/kg nevyvolává příznaky toxicity pro embryo, nebo teratogenitu, není třeba považovat za nutné provedení studií při jiných hladinách dávek. Když předběžná studie s nejvyšší hladinou a zřetelným pozorováním toxicity u matek, nevyvolává škodlivé účinky na embryo, není třeba považovat provedení studií při jiných hladinách dávek za nutné.

1.6.2.4. Doba expozice
Dnem 0 testu je den v němž byl pozorován vaginální čípek (kde to je proveditelné) a nebo sperma, nebo den v němž bylo provedeno krytí a pozorováno. Dávkovací perioda má pokrýt hlavní období organogenese. To lze považovat za den 6. - 15. u krys a myší a 6. - 18. u králiků.

1.6.2.5. Podmínky ustájení a krmení
Zvířata je třeba ustájit individuálně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata má být 22^oC + - 3^oC a relativní vlhkost 30 - 70%. Pokud je osvětlení umělé, je třeba zachovávat střídání 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení se používá obvyklých laboratorních dávek s neomezenou zásobou pitné vody. Gravidní samičky by měly být zásobeny materiálem na stavbu hnízda, ačkoliv to není považováno za podstatné.

1.6.2.6. Cesta administrace
Zkoušená látka se obvykle aplikuje orálně dávkováním do žaludku. V obměnách lze však použít i jiných způsobů pokud jsou více podobné možným cestám expozice člověka. Zkoušenou látku je třeba aplikovat v přibližně stejnou dobu každý den.

1.6.2.7. Pozorovací perioda
Pokusná zvířata je třeba pozorovat denně na příznaky toxicity po celou dobu periody aplikace. Je třeba zaznamenat dobu při níž se známky toxicity objevují.

1.6.3. Postup
Samiččí zkušební zvířata se dávkují zkoušenou látkou denně po celou dobu provádění pokusu. Pokud se aplikuje dávkováním do žaludku musí být dávka vztažena na hmotnost pokusného zvířate - samičky na počátku dávkování, nebo alternativně s ohledem na rychlý přírustek hmotnosti, který nastává během gravidity, proto mají být zvířata vážena periodicky a dávka vztažena vždy na nejaktuálnější stanovení hmotnosti. Všechna zvířata je třeba pozorovat denně a všechny příznaky toxicity zaznamenávat, včetně doby počátku, stupně a trvání. Samice u nichž došlo k příznakům potratu nebo předčasného porodu je třeba utratit a podrobit pečlivému makroskopickému průzkumu. Poaplikační perioda pozorování má pokračovat přibližně až do dne před termínem porodu, požadavkem je pokrytí co největšího úseku gravidity, ale zabránit komplikacím interpretace výsledků, které by nastaly normálním porodem. Během periody aplikace a pozorovací periody by měla pozorování v kleci zahrnovat, ne se však omezovat na pozorování změn pokožky a srsti, očí a sliznic stejně jako systému dýchacího, cirkulačního, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a způsobu chování. Týdně je třeba provádět měření spotřeby krmiva. Zvířata je třeba vážit nejméně dvakrát týdně.

1.6.3.1. Pitva
V době utracení, nebo úhynu během studie je třeba samici makroskopicky prozkoumat na jakékoliv abnormality, které by mohly ovlivnit graviditu. Bezprostředně po utracení nebo úhynu je třeba vyjmout dělohu a její obsah prozkoumat na úhyn embrya nebo foetu a počet živých foetů. Zpravidla je možno určit čas úhynu "in utero", když k němu došlo. U krys a králíků je třeba stanovit počet žlutých tělísek. Plody a jejich placenty je třeba zvážit zvláště, hmotnost se zaznamená a vypočítá se průměrná hmotnost foetu. Po vyjmutí je třeba každý foetus posoudit externě. U krys a myší je třeba jednu třetinu až jednu polovinu vrhu preparovat a prozkoumat na skeletální anomálie, a zbylou část prozkoumat odpovídajícími metodami na jemné anomálie tkání. U králíků se každý foetus zkoumá pečlivou pitvou na vnitřní anomálie a pak zkoumá na skeletální anomálie.

2. Data
2.1.1. Data mají být sumarizována do tabelární formy obsahující pro každou pokusnou skupinu počet zvířat na počátku zkoušky, počet zvířat, která se stala gravidními, počet a procentické vyjádření živých plodů a plodů s jemnými abnormalitami tkání a skeletu.

2.1.2. Kdykoliv to je možné, je třeba všechny pozorované výsledky vyhodnotit odpovídající statistickou metodou. Je možno použít jakékoliv přijaté statistické metody. Statistickou metodu je třeba volit jako část plánu studie.

2.2. Vyhodnocení
Nálezy zjištěné teratogenickou studií je třeba vyhodnocovat v souvislosti s pozorovanými účinky a hladinou dávky účinku vyvolávající. Je třeba znát teratogenické údaje pokusného druhu - kmene. Správně provedená teratogenická studie může poskytnout uspokojivé stanovení hladiny nulového účinku (no-effect level).

3. Zprávy

3.1. Zkušební zpráva
Zkušební zpráva musí zahrnovat následující informace: